La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio que permite la creación de numerosas copias de una cadena de ADN. Aprovecha la capacidad de las enzimas polimerasas para replicar material genético.
El ácido desoxirribonucleico (ADN) juega un papel fundamental en diversos estudios de investigación que involucran organismos vivos. Al examinar el código de ADN, podemos comprender la base genética de enfermedades, desarrollar medicamentos, realizar pruebas forenses, identificar microorganismos y mucho más.
Sin embargo, para dicha investigación, se requiere una cantidad significativa del fragmento de ADN bajo investigación. Desafortunadamente, el ADN obtenido de células, tejidos u otras fuentes biológicas a menudo es insuficiente para el análisis. Por lo tanto, los científicos necesitan producir copias adicionales del ADN.
Aquí es donde se vuelve esencial la «Reacción en Cadena de la Polimerasa».
¿Qué es la Reacción en Cadena de la Polimerasa?
La PCR utiliza la capacidad de replicación de las enzimas polimerasas para generar copias de material genético en un entorno de laboratorio.
Antes de la PCR, las copias de ADN se producían mediante el aislamiento de un fragmento específico de ADN e insertándolo en el genoma de células vivas. Estas células vivas luego replicarían el ADN insertado junto con su propio material genético. Esta técnica era lenta y laboriosa, lo que dificultaba obtener suficientes copias de ADN para estudios posteriores.
Sin embargo, gracias a Kary Mullis, quien inventó la PCR en 1983, esto ya no es así. La PCR marcó el comienzo de la «Revolución de la Biotecnología» y se ha convertido en una técnica de laboratorio comúnmente utilizada, incluso en laboratorios más pequeños, para generar regularmente copias de ADN.
La PCR puede amplificar selectivamente el ADN de interés a través de un proceso a menudo denominado «fotocopiado molecular». Una vez que se sintetizan múltiples copias del ADN utilizando la PCR, el ADN se amplifica.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica in vitro que utiliza la polimerasa de ADN para producir múltiples copias del ADN deseado. (Crédito de la foto: kozhedub_nc/Shutterstock)
¿Cuáles son los componentes de una reacción de PCR?
Una reacción de PCR consta de varios componentes esenciales, incluyendo ADN plantilla, cebadores, nucleótidos y ADN polimerasa termoestable. Vamos a explorar brevemente cada uno de estos componentes.
La PCR puede utilizar ADN de varios organismos, desde bacterias simples hasta animales y plantas complejas. Sin embargo, solo se amplifica una pequeña sección del ADN (conocida como ADN plantilla) durante el proceso de PCR, no todo el ADN.
Para que ocurra la amplificación, los cebadores desempeñan un papel crucial. Estas son secuencias cortas de nucleótidos, de aproximadamente 20 pares de bases de longitud. Se utiliza un conjunto de cebadores, que consta de un cebador hacia adelante y un cebador hacia atrás. Estos cebadores se unen al inicio y al final de las hebras de ADN, indicando los puntos desde los cuales se debe amplificar el ADN.
Los nucleótidos utilizados en la PCR son una mezcla de las cuatro bases nitrogenadas encontradas en el ADN: adenina (A), timina (T), guanina (G) y citosina (C).
El componente final y más importante es la ADN polimerasa. Esta enzima crea nuevas moléculas de ADN ensamblando nucleótidos de manera que complementen la hebra existente. De esta manera, puede generar dos moléculas de ADN idénticas a partir de una sola hebra de ADN.
Además de la enzima, se deben incluir cofactores necesarios para la actividad de la ADN polimerasa en la mezcla de reacción. Los cofactores son compuestos metálicos que desempeñan un papel crítico en la función de la enzima. Iones de magnesio sirven como cofactores para la ADN polimerasa.
La ADN polimerasa utilizada en la PCR es una enzima termoestable (a menudo referida como Taq polimerasa) aislada de organismos termofílicos capaces de sobrevivir a altas temperaturas.
Los componentes de una reacción de PCR incluyen ADN plantilla, ADN polimerasa Taq, MgCl2 como buffer, bases nucleotídicas (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), cebador hacia adelante, cebador hacia atrás y agua ultra pura. (Crédito de la foto: Oscar Daniel Luna Ramos/Shutterstock)
¿Cómo funciona una reacción de PCR?
Después de comprender los componentes necesarios para la PCR, exploremos los tres pasos principales involucrados en una reacción de PCR. Estos pasos consisten en la desnaturalización, la hibridación y la extensión.
Para que la polimerasa funcione, debe estar presente ADN de cadena simple para que los cebadores se puedan unir. Esto se puede lograr calentando la muestra de ADN a una temperatura de 94-98°C.
El calentamiento provoca que los enlaces que mantienen unidas las dos cadenas de ADN se rompan, lo que resulta en la desnaturalización del ADN de doble cadena en dos moléculas de cadena simple separadas. Una de estas cadenas se denomina cadena molde, mientras que la otra se conoce como cadena complementaria.
El siguiente paso implica la unión (hibridación) de los cebadores a sitios específicos en el ADN molde. El cebador hacia adelante se une al inicio del ADN molde (una de las cadenas en el ADN de doble cadena) en la secuencia de nucleótidos ATG (códon de inicio). El cebador inverso se une al final del ADN complementario (la segunda cadena del ADN de doble cadena) en las secuencias de nucleótidos TAG, TAA o TGA (códones de parada). El ADN entre los códones de inicio y parada se amplifica.
El éxito de este paso depende de la secuencia de los cebadores y la temperatura elegida para la hibridación, que generalmente oscila entre 50-65°C.
El paso final en el proceso es la elongación o terminación, que ocurre a 72°C, la temperatura óptima para la Taq polimerasa. La polimerasa de ADN reconoce la región de ADN unida por el iniciador y agrega nucleótidos complementarios a la hebra de ADN molde. Esto continúa hasta que llega al segundo iniciador.
Después de una reacción de terminación exitosa, habrá dos hélices de ADN en lugar de la original utilizada al principio. En cada hélice, una hebra será del muestra de ADN original, mientras que la otra hebra será sintetizada por la polimerasa de ADN durante la PCR.
La reacción de PCR consta de tres pasos: desnaturalización, apareamiento y elongación o terminación. (Crédito de la foto: Flickr)
¿Cómo funciona la amplificación de ADN utilizando PCR?
El proceso de PCR involucra tres pasos: desnaturación, hibridación y polimerización. Para lograr una amplificación óptima del ADN, una reacción típica de PCR puede pasar por 25-35 ciclos.
Después de un ciclo, la plantilla de ADN original producirá dos moléculas de ADN. Después de dos ciclos, estas dos moléculas formarán cuatro moléculas de ADN, las cuales se amplificarán a ocho moléculas después de tres ciclos. Este aumento exponencial continúa, resultando en 2n copias de la plantilla de ADN inicial después de n ciclos.
Después de cada ciclo, la cantidad de moléculas de ADN disponibles como plantillas para el siguiente ciclo crece de manera exponencial. Este crecimiento exponencial es el principio fundamental detrás de la amplificación de ADN utilizando PCR.
La técnica de PCR permite la amplificación exponencial de moléculas de ADN (Crédito de la foto: Enzoklop/Wikimedia commons)
Ventajas y Desventajas de la PCR
La PCR tiene varias ventajas como técnica. Es capaz de producir rápidamente millones a miles de millones de copias de ADN en tan solo unas horas. También es relativamente fácil de aprender y se puede realizar en condiciones básicas de laboratorio.
Sin embargo, también hay desventajas en la PCR. La técnica es altamente sensible, requiriendo que la muestra esté libre de contaminantes. Incluso pequeñas trazas de ADN no deseado pueden amplificarse junto con el ADN de interés, lo que lleva a resultados falsos. Además, la PCR requiere información de secuencia del ADN para diseñar cebadores, y hay riesgo de un apareamiento no específico, lo que resulta en la amplificación del fragmento de ADN incorrecto. En casos raros, la polimerasa de ADN puede incorporar una base incorrecta, alterando la secuencia del ADN de interés.
Para realizar la PCR con éxito, se necesitan material genético puro, cebadores apropiados y una temperatura de apareamiento adecuada.
Aplicaciones de la PCR
La PCR tiene diversas aplicaciones en diferentes campos. Se utiliza comúnmente para el aislamiento selectivo de ADN a partir de muestras de ADN mixtas, ayudando en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, enfermedades genéticas y ciertos tipos de cáncer. La PCR también se utiliza en ciencias forenses para la identificación criminal y las pruebas de paternidad.
Además, la PCR es fundamental para muchas aplicaciones de biología molecular, incluyendo la clonación de genes, la tecnología de ADN recombinante y la mutagénesis.
Conclusión
La técnica de PCR, desarrollada por Kary Mullis, ha revolucionado la investigación biológica. Simplemente mezclando los componentes necesarios en un tubo pequeño y utilizando una máquina de PCR, los investigadores pueden obtener millones a miles de millones de copias del ADN de interés en solo unas pocas horas. Este método rápido y confiable ha mejorado enormemente la amplificación de ADN en comparación con las técnicas anteriores.